【前言简介】
可的松(氢化可的松,复合物F)是人体中一种主要的糖皮质激素,它是由肾上腺皮质的束状带产生的。90%的循环可的松会结合到可的松结合球蛋白(CBG,皮质激素传递蛋白)上,7%的循环可的松会结合到白蛋白上,仅1-3%的循环可的松是以游离状态存在。仅仅游离状态的可的松才具有活性。游离可的松释放到唾液中,并作为可的松的一小部分代谢产物从肾脏排出。血液中游离可的松的水平可以以负反馈的形式通过下丘脑分泌的CRH(促肾上腺皮质激素释放激素)和垂体分泌的ACTH(促肾上腺皮质激素)来调节可的松的分泌,但可的松的水平也会受各种因素的影响。人体内的可的松有一个生理波动,在早晨达到最高水平,在夜间则达到最低水平。血浆可的松的这种起伏波动在唾液中可表现为:在人醒后的90分钟内达到最高水平。糖皮质激素分泌不正常的疾病可通过可的松的检测表现出来,如:库欣综合征和阿森氏疾病。因为可的松水平存在着日变化,所以在做个体可的松筛查或动力学实验(如地塞米松抑制实验或ACTH刺激实验)时应多采集几个时段的样品。唾液样品的采集是一个简单的采样方法,不需要方法静脉穿刺取样。孕妇、甲状腺功能低下、肾病综合征、明显肥胖和接受了不同药物治疗(包括口服避孕药)患者的CBG水平可能会不正常,所以建议检测其唾液可的松。
【检测原理】
此酶联免疫吸附实验采用的是竞争法的原理。样品中未知量的抗原和一定量的酶标抗原竞争性结合包被在包被孔中的抗体结合位点。温育后洗板以终止竞争反应,加入底物液后,溶液所显示的颜色强度与样品抗原的量成反比。而样品的结果可直接从标准曲线上读取。
检测步骤
1) 将标准品、质控品和样品分别50μl加入到相应的微孔中。
2) 在每一微孔中加入100μl酶联物,盖板,轻轻振板。
3) 室温(18-25℃)振荡器上(400-600rpm)温育2小时。
4) 移去封板纸,弃取孔内反应液,每孔用250μl稀释好的洗涤液洗板4次。最后在吸水纸上拍干一除去残余液体。
5) 在每一微孔中加入100μl TMB底物液。
6) 室温(18-25℃)振荡器上(400-600rpm)温育30分钟。
7) 在每一微孔中加入100μl TMB终止液以终止底物反应,轻轻振板,溶液由蓝色变成黄色。
8) 加终止液后15min内450nm处读取OD值(参考波长:600-650nm)
【结果计算】
在半对数坐标纸上或自动计算的方法,以标准品的OD值(Y轴,线性)对其浓度(X轴,对数)做一条标准曲线。使用三次回归、四参数或双对数曲线方程可以得到更好的标准曲线。在推算标准曲线时,应当充分利用好每一个标准品数值(明显逸出的数值应当被忽略,再使用更加合理的数值代替它)。样品的浓度可以从标准曲线上直接读取。检测结果明显提高的唾液样品应当是被血液污染了。
转换系数:
可的松(ng/ml)×2.76 = nmol/L
可的松(μg/dl)× 27.6 = nmol/L
结果报告范围:
唾液: 0.015—3μg/dL 可的松