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酶联免疫吸附试验在我国布氏杆菌病流行区的诊断中优于细菌培养和凝集试验
时间:2020-01-13 点击次数:186

酶联免疫吸附试验在我国布氏杆菌病流行区的诊断中优于细菌培养和凝集试验

传染性疾病 20,文章编号:112020)引用这篇文章

摘要

背景

布鲁氏菌病是中国许多地区的地方病。目前布鲁氏菌病的诊断主要依靠传统的细菌培养和血清凝集试验。本研究旨在探讨酶联免疫吸附试验在中国人群布鲁氏菌病诊断中的价值。

方法

我们招募了235名在不同临床阶段诊断为布鲁氏菌病的患者:急性117名,亚急性78名,慢性40名。我们还招募了248名临床症状相似但诊断不同于布鲁氏菌病的对照患者。此外,还招募了90名健康志愿者。采用细菌培养、凝集试验和酶联免疫吸附试验检测布鲁氏菌。

结果

235例布鲁氏菌病患者中,细菌培养阳性51(21.7%),凝集试验阳性150(63.8%),酶联免疫吸附试验阳性232(98.7%)。当我们根据疾病阶段(急性、亚急性和慢性)对患者进行分层时,酶联免疫吸附试验是最敏感的方法,在所有阶段都显示出最高的阳性率。通过对酶联免疫吸附试验结果的受试者操作特性曲线分析,我们发现IgG水平的测量优于IgM水平的测量(AUC0.9930.877)。由于免疫球蛋白测定本身遗漏了急性期的罕见病例,我们建议用酶联免疫吸附试验同时测定免疫球蛋白和免疫球蛋白,用于布鲁氏菌病的诊断。就酶联免疫吸附试验诊断布鲁氏菌病的特异性而言,我们的研究表明,只有1.6% (4/248)的非布鲁氏菌病患者酶联免疫吸附试验呈阳性;所有阳性病例均为IgM,无一例呈阳性。健康志愿者也有类似的结果。综上所述,本研究认为酶联免疫吸附试验是检测中国人群布鲁氏菌病最敏感、最特异的方法。

结论

酶联免疫吸附试验检测布鲁氏菌病灵敏、快速、方便。它具有较高的灵敏度和特异性,在临床怀疑布氏杆菌病时,应作为常规实验室检测。

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背景

布鲁氏菌病,又称地中海热,是由布鲁氏菌属物种引起的人畜共患传染病。它感染人类和动物,如绵羊、牛、山羊、猪和狗。引起人类感染的细菌包括三种主要类型:羊栖菜,B.流产,瑞士布氏菌和梅列坦斯布氏菌是最常见的[1】。近年来,[也发现了一些新物种2,3,4,5】。布鲁氏菌病通过几种方式从动物传播给人类。最常见的传播途径发生在人类食用由受感染动物制成的生牛奶或奶酪时。这种疾病也可以通过吸入生物体或直接接触受感染动物的分泌物或粪便传播给人类。感染布鲁氏菌的患者通常表现为发热、出汗、关节痛、肝脾肿大和淋巴结病。

20世纪90年代以来,我国布鲁氏菌病的发病率显著上升,逐渐成为最流行的传染病之一。2016年,报告了47139例病例,发病率为3.44/100000。中国北方是[的主要流行区6】。除了中国,地中海盆地、墨西哥、东欧、非洲和中东等许多其他地区也面临布鲁氏菌病的高风险。鉴于布鲁氏菌病的高流行率,有必要进行快速可靠的诊断试验。

布鲁氏菌病是可以治疗的,但早期诊断并及时进行医疗干预是关键。目前我国布鲁氏菌病的诊断主要依靠血培养和血清凝集试验[7,8,9]..急性期患者的阳性率通常高于亚急性期和慢性期[患者10,11],但由于整体灵敏度低,阴性血培养不能排除布鲁氏菌病。血清凝集试验在许多医院使用,但也有其自身的问题;由于中国大部分地区是地方性的,正常人群的抗体滴度水平较低,很难设置一个阈值来平衡灵敏度和特异性,从而导致一些假阳性和假阴性结果。用于检测布鲁氏菌病的酶联免疫试剂盒是市售的。该方法快速、简便,可同时检测细菌表面抗原的IgGIgM,有望成为检测[布鲁氏菌病的有效工具12】。到目前为止,我国还没有系统的研究将酶联免疫吸附试验与传统方法如血培养和凝集试验进行比较。本研究旨在评价酶联免疫吸附试验在布鲁氏菌病诊断中的价值,并与目前临床应用的检测方法进行比较。

方法

研究队列

20165月至20188月期间,我们招募了两组住院患者。这些病人来自中国东北地区。第一组包括235名被诊断患有布鲁氏菌病的患者。布鲁氏菌病的诊断基于适当的临床背景,包括病史(职业暴露或食用生乳制品/肉制品或生活流行区)、临床表现(发热、出汗、关节痛、肝脾肿大)和实验室研究,以及至少下列结果之一为阳性:细菌培养、凝集试验或酶联免疫吸附试验。第2组包括248名患者,他们的临床表现相似,但后来证实患有布鲁氏菌病以外的疾病(系统性红斑狼疮、病毒和细菌感染)。除了这两个病人组,我们还招募了90名健康志愿者作为对照。收集所有临床信息,包括年龄、性别、临床表现、实验室研究、治疗史和接触史。

本研究获得齐鲁医院伦理委员会的批准。所有的病人和志愿者都签了同意书。

细菌培养

收集患者血液并转移至血液培养瓶(巴克斯特plus/F;贝克顿·迪金森,美国新泽西州富兰克林湖),在巴克斯特系统(新泽西州贝克顿·迪金森诊断仪器系统)中孵育,直至获得阳性结果或最多10天。根据革兰氏阴性球菌、脲酶和氧化酶阳性以及特异性抗血清的阳性凝集,对分离株进行鉴定。

血清凝集试验

标准试管凝集抗原购自中国疾病预防控制中心。使用苯酚盐水将患者血清从1:10连续稀释至1:1280。加入布鲁氏菌抗原,混合物在37孵育24小时。将所有试管与对照试管(阳性和阴性对照)进行比较,以检查凝集。滴度≥1:100,最低凝集率为50%,被视为阳性。

酶联免疫吸附试验

酶联免疫试剂盒购自德国IBL国际有限公司。按照制造商的说明进行酶联免疫吸附试验,阳性抗体试验的临界值≥12u/ml。简而言之,对于IgG检测,患者血清以110稀释,并且将100微升稀释的血清加入每个孔中孵育1小时。洗涤后,加入酶结合试剂30分钟。在另一轮洗涤后,加入酶底物20分钟。添加停止缓冲液,并在450纳米处测量外径值。使用质控品的外径值建立标准曲线。根据标准曲线计算测试样品的值。对于IgM抗体的检测,程序类似于程序前额外的预吸收步骤。

统计分析

格拉帕德棱镜7.0(格拉帕德,拉乔拉,加利福尼亚州,美国)用于数据分析,包括计算灵敏度、特异性、假阴性和假阳性值。为了评价免疫球蛋白和免疫球蛋白的诊断价值,建立了受体工作特性曲线(ROC曲线)和曲线下面积(AUC)。成对x2凝集试验与酶联免疫吸附试验进行比较。P%3C 0.05被认为具有统计学意义。

结果

临床特征

布鲁氏菌病患者和对照患者的临床特征见表1。诊断为布鲁氏菌病的患者进一步细分为培养阳性组和培养阴性组,其临床特征列于表中2。如表中所示2,这两组的临床和实验室结果没有统计学差异。布鲁氏菌病患者初次入院时,117(50%)处于急性期(%3C 8)78(33%)处于亚急性期(8-24)40(17%)处于慢性期(%3E 24)。首次入院前的发热持续时间从6天到2年不等。在布鲁氏菌病患者中,有138(58.7%)因职业暴露,包括农民、兽医和乳制品行业专业人员等,其余患者要么生活在流行地区,要么有食用生乳制品或肉制品的历史。

1布鲁氏菌病患者和非布鲁氏菌病对照患者的人口学和临床特征

 

布鲁氏菌病患者和非布鲁氏菌病对照患者的人口学和临床特征

2培养阳性和培养阴性布鲁氏菌病患者的人口学和临床特征

培养阳性和培养阴性布鲁氏菌病患者的人口学和临床特征

 

化验所见

血培养、凝集试验和酶联免疫吸附试验的结果列于表中3235例布鲁氏菌病患者中,血培养阳性51(21.7%),凝集试验阳性150(63.8%)。相比之下,酶联免疫吸附试验显示高阳性率为98.7% (232/235) (IgG/IgM阳性)。使用McNemar x进行统计分析2试验表明酶联免疫吸附试验对布鲁氏菌病的检测优于血培养和凝集试验(P%3C 0.01)。分别分析IgGIgM时,酶联免疫吸附试验对IgM的总阳性率为60.9%,抗体水平为1.07-83.7 U/ml(Q1四分位中位数为16.81 U/mlQ3分别为7.96 U/ml28.85 U/ml)。相比之下,IgG的总阳性率较高,为96.2%,抗体水平在2.09700 U/毫升之间(Q1四分位中位数为42.83 U/毫升,Q3分别为22.02 U/毫升和78.55 U/毫升)。在酶联免疫吸附试验中,仅有3(1.3%)患者的IgGIgM结果均为阴性(%3C12u/ml)3例患者中,1例血培养阳性,凝集试验阴性;该患者病程较短,发热6天,两周后,重复酶联免疫吸附试验显示抗体和抗体呈阳性。其余2例酶联免疫吸附试验结果阴性的患者血培养也呈阴性,但凝集试验呈阳性,两例患者均在入院前接受了多轮经验性抗生素治疗。

3235例布鲁氏菌病患者进行培养、免疫吸附试验和酶联免疫吸附试验的结果

对235例布鲁氏菌病患者进行培养、免疫吸附试验和酶联免疫吸附试验的结果

 

248名对照患者中,没有患者显示布鲁氏菌属阳性培养。凝集试验阳性14(6.45%)4(1.61%)患者酶联免疫吸附试验呈阳性,均为单抗阳性,本组无一例患者酶联免疫吸附试验呈阳性。通过酶联免疫吸附试验测定的这些对照患者的抗体水平范围为0.5-49.58 U/毫升(四分位Q1Q3的中位数分别为2.75 U/毫升:1.49 U/毫升和4.86 U/毫升),抗体水平范围为0.5-11.8 U/毫升(四分位Q1Q3的中位数分别为2.835 U/毫升和4.158 U/毫升)

为了评估正常人群的背景抗体滴度,我们招募了90名健康成人进行酶联免疫吸附试验。一个(1.1%)显示在30.8 U/毫升时IgM升高,抗体水平在0.5-30.8 U/毫升之间(四分位Q1Q3的中位数分别为2.34 U/毫升:1.528 U/毫升和4.31 U/毫升)。没有显示出升高的IgG,抗体水平在1.03-10.93 U/毫升之间(Q1四分位和Q3的中位数分别为2.27 U/毫升:1.718 U/毫升和3.153 U/毫升)

然后,我们将布鲁氏菌病患者、对照患者和正常健康对照者的所有结果进行合并和比较,并计算敏感性和特异性。如表中所示4与凝集试验(灵敏度0.638,特异性0.935)相比,酶联免疫吸附试验显示出较高的灵敏度(0.987)和特异性(0.984)p%3C 0.001P= 0.012)

4各种试验的灵敏度、特异性、真阳性和真阴性值

各种试验的灵敏度、特异性、真阳性和真阴性值

 

布鲁氏菌病不同阶段的实验室发现

接下来我们只关注布鲁氏菌病组,并根据疾病阶段(急性,117例;亚急性,78例;和慢性阶段,40)。血培养、凝集试验和酶联免疫吸附试验结果汇总于表中5。血培养阳性仅见于急性期(36.8%43/117)和亚急性期(10.3%8/78),慢性期患者血培养均未见阳性。凝集试验阳性率呈相似趋势,急性期阳性率最高(75.2%),亚急性期为57.7%,慢性期为42.5%。相比之下,酶联免疫吸附试验在疾病的所有阶段都显示出高阳性率:急性阶段为98.3%,亚急性阶段为100%,慢性阶段为97.5%。使用McNemar x进行统计分析2表明酶联免疫吸附试验比血液培养和凝集试验在疾病的各个阶段均优于布鲁氏菌病(p%3C 0.001)

5布鲁氏菌病不同阶段的血培养、血清白蛋白和酶联免疫吸附试验结果(各试验阳性病例的数量和百分比)

布鲁氏菌病不同阶段的血培养、血清白蛋白和酶联免疫吸附试验结果(各试验阳性病例的数量和百分比)

 

酶联免疫吸附试验测定的免疫球蛋白和免疫球蛋白在布鲁氏菌病诊断中的不同价值

如前所述,我们用酶联免疫吸附法同时测定了免疫球蛋白和免疫球蛋白。如表中所示5IgMIgG阳性率不同。IgM阳性率随着疾病的持续和延长而降低:急性噬菌体为79.5%,亚急性期为55.1%,慢性期为17.5%。相比之下,IgG的阳性率在疾病的所有阶段都保持在高水平:急性期为94%,亚急性期为100%,慢性期为95%。我们用ROC曲线和AUC计算来评价IgMIgG的诊断价值。如图所示1IgGAUC值为0.993 (95%置信区间,0.988–1.000),高于IgMAUC(0.87795%置信区间,0.846–0.909)IgMIgG的敏感性和特异性用绘图板计算。如表中所示4灵敏度对IgM0.609,对IgG0.961,特异性对IgM0.984,对IgG1.00。总之,IgG的整体诊断价值优于IgM。值得注意的是,在5IgM阳性的急性患者中,IgG未能检测到疾病,因此同时测量IgMIgG将产生最佳诊断值。

1

对IgG和IgM进行接收器操作特性分析,以确定区分布鲁氏菌病和非布鲁氏菌病的阈值

IgGIgM进行接收器操作特性分析,以确定区分布鲁氏菌病和非布鲁氏菌病的阈值

 

临床随访

在诊断出布鲁氏菌病后,对患者进行抗布鲁氏菌病药物治疗。治疗后246周,我们对患者进行了随访。235例布鲁氏菌病患者中,10例失访,其中培养阳性组2例,培养阴性组8例。收集患者的临床症状、全血计数、肝肾功能、炎症参数以及用药依从性。我们总结了他们的临床反应,并在附加文件中列出1以下内容:S1。如表中所示,大多数患者对治疗反应良好,少数患者出现治疗失败或疾病复发。

讨论

20世纪90年代以来,我国布鲁氏菌病的发病率以较快的速度上升。在过去10年中,[的发病率每年稳步增长约7.8%13】。根据世卫组织的评估,布鲁氏菌病患者的实际人数要高得多,大约是[报告病例的10-2514】。报告发病率和实际发病率之间的巨大差异主要是由于误诊和诊断不足,特别是在流行地区。对于布鲁氏菌病,金标准诊断分析是细菌培养。然而,在亚急性和慢性阶段,培养往往是阴性的。在本研究招募的235名连续患者中,超过一半的患者已经超过急性期(3E 8)。结果,血培养阳性率仅为21.7%,与之前[公布的结果相似15,16】。

中国目前使用的主要血清学研究是凝集试验。与细菌培养相似,凝集试验的阳性率随着疾病持续时间的延长而降低17,18】。在我们的研究中,慢性期阳性率低于50%(5)。即使在细菌培养呈阳性的急性期,[患者也会出现假阴性结果19,20](在我们的研究中为19.6%)。凝集试验的另一个潜在问题是存在与其他细菌的交叉反应,如小肠结肠炎耶尔森菌、urbana群沙门氏菌、霍乱弧菌和土拉弗朗西斯菌,从而导致[假阳性7】。最后,我国布鲁氏菌病的官方诊断标准为%3E 1:100,凝集明显(%3E 50%),低于世界卫生组织提出的标准(% 3E 1160)。鉴于中国许多地区是地方性的,正常人群中存在背景阳性,这可能导致假阳性结果(本研究中为6.45%)

在本研究中,我们证明酶联免疫吸附试验对布鲁氏菌病的检测比凝集试验具有更高的灵敏度和特异性,与[以前的一些研究相一致21,22,23】。培养阳性病例中,酶联免疫吸附试验阳性率为98%,凝集试验阳性率为80.4%。随着疾病的进展,培养物和凝集素试验的阳性率显著下降,而酶联免疫吸附试验仍保持其高阳性率。这一点尤其重要,因为中国的许多患者(目前研究中的50%)最初入院时处于亚急性和慢性阶段,在这些阶段,血培养和凝集素显示出低阳性。

酶联免疫吸附试验显示,在抗体和抗体之间,抗体具有更高的灵敏度和特异性,有更好的诊断作用。其他疾病患者和正常健康人群中未见IgG升高。相反,IgM升高在其他疾病中很少见到;在本研究中,2例自身免疫性疾病患者显示IgM升高。在90名健康对照中,我们还发现1IgM升高。虽然IgG优于IgM,但建议同时测量IgGIgM,因为IgG在急性期很少呈阴性;在我们的研究中,5例布鲁氏菌病最初表现为分离的IgM升高,但没有升高的IgG水平;所有患者均处于急性期,随访1个月后,IgG变为阳性。因此,对于IgG阴性的急性期患者,我们建议在2-4周后重复测试。值得注意的是,在我们的研究中,有两个病例在初次报告和随后的随访中,通过酶联免疫吸附试验均为阴性。一个有3周的病程,另一个有8个月。两个病人入院前都有抗生素治疗史。先前的研究表明,在[酶联免疫吸附试验中,抗菌治疗可以降低抗体滴度24,25】。我们的随访研究始终表明,在初始诊断结果为阳性的患者中,治疗后2个月抗体滴度显著下降(数据未显示)。因此,先前的抗生素治疗很可能是酶联免疫吸附试验假阴性结果的原因。虽然酶联免疫吸附试验对布鲁氏菌病的诊断显示出很高的灵敏度和特异性,但我们应该知道它是一种基于抗体的试验,因此在流行区正常人群中患者的免疫状态和背景抗体滴度会影响试验,并可能导致一些假阴性或假阳性结果。我们建议将酶联免疫吸附试验结果的解释与临床和实验室结果结合起来。

结论

总之,利用由235名布鲁氏菌病患者、248名对照患者和90名健康人组成的大队列,我们证明酶联免疫吸附试验在检测布鲁氏菌病的各个阶段具有最高的灵敏度和特异性。它优于血培养和凝集试验。鉴于其快速的周转时间和相对简单和标准化的方案,我们强烈建议在布鲁氏菌病鉴别诊断的日常临床实践中使用酶联免疫吸附试验。这在中国和许多其他地方病地区尤其有价值,因为这些地区的许多患者最初表现为亚急性或慢性阶段。

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